Fred (Robbie Amell), Velma (Hayley Kiyoko), Daphne (Kate Melton) e Salsicha (Nick Palatas) estão de férias do colégio e das investigações sobrenaturais. Porém, após a lenda de um monstro no lago parecer estar se tornando real, os amigos vão se juntar ao inseparável cão Scooby-doo para tentar decifrar ester mistério.

Em Coolsvile, Ohio, quatro adolescentes se envolvem numa discussão no ônibus escolar e são mandados para a detenção do colégio. Salsicha é um nerd desajeitado, que tentou entrar com seu cão Scooby-doo na condução escolar, Fred Jones é um atleta do time de futebol americano, Velma Dinkley é uma estudante de ciências dedicada e Daphne Blake é do grupo de teatro. Eles percebem que tem um interesse em comum: os mistérios sobrenaturais. Durante o período de detenção na biblioteca da escola, dois fantasmas aparecem e começam a perseguir o grupo. É assim que se forma a Mistério S.A. Os quatro amigos e seu inseparável cão Scooby vão se envolver em muitas aventuras.

Após se reencontrarem e reativarem a Mistérios S.A., Fred (Freddie Prinze Jr.), Daphne (Sarah Michelle Gellar), Salsicha (Matthew Lillard), Velma (Linda Cardellini) e Scooby-Doo partem rumo a Coolsville para desvendar mais um mistério. Lá está um homem mascarado, que planeja usar uma máquina criadora de monstros para controlar o lugar. Em meio às investigações eles conhecem Patrick Wisely (Seth Green), o curador do museu local, e ainda Heather Jasper-Howe (Alicia Silverstone), uma repórter que se apaixona por Fred.

Após a Mistério S/A - formada por Fred (Freddie Prinze Jr.), Daphne (Sarah Michelle Gellar), Velma (Linda Cardellini), Salsicha (Matthew Lillard) e Scooby-Doo - resolver um caso em uma fábrica de brinquedos o grupo se desfaz, pois alguns dos membros não suportavam ver Fred creditando sempre para si os feitos mais difíceis. Eles ficam sem se ver por dois anos, até Emile Mondavarious (Rowan Atkinson), o dono de um parque temático chamado "A Ilha do Espanto", contratar cada um deles para resolver um mistério envolvendo o parque. Porém nenhum deles sabia que cada um dos ex-parceiros também fora contratado, com o grupo se encontrando na hora do embarque e concordando em trabalhar juntos mais uma vez. Ao chegarem à Ilha do Espanto eles são recebidos por Mondavarious, que lhes diz acreditar que alguém jogou uma praga na ilha, pois os jovens chegam normais mas ao saírem são pessoas bem diferentes, muito mais sérios e agressivos. Daphne, Velma e Fred iniciam uma disputa particular para ver quem resolve o caso primeiro, sem imaginarem quem está por trás dos acontecimentos da Ilha do Espanto.